Começou sua carreira na televisão na série/novela General Hospital como Blackie Parrish. Depois, ele se juntou ao elenco de Três É Demais, seriado da ABC, como Adam Cochran, mas mudou o nome de seu personagem para Jesse antes da estréia da série. Na 2ª Temporada, ele mudou também o sobrenome de seu personagem para Katsopolis para evidenciar sua herança grega, da qual ele tem muito orgulho. A série durou até a 9ª temporada.
John Stamos também fez inúmeras aparições em filmes feito para a televisão, peças de teatro e comerciais. Ele tem uma ativa carreira em música, tendo sido bateirista do grupo The Beach Boys, também tendo aparecido na Broadway como o Mestre de Cerimônias em Cabaret, em Nine e How To Succeed In Business Without Even Trying.
Ele estrelou a série Thieves (exibida no Brasil pelo SBT como Os Vigaristas) em 2001 no papel principal, recentemente tendo estrelado e protagonizado também a série Jake in Progress. Atualmente, John Stamos encontra-se no elenco fixo da 13ª Temporada do veterano drama médico ER (Plantão Médico) no papel do paramédico, médico interno e veterano da Guerra do Golfo Tony Gates.
